viernes, 6 de abril de 2012

Medios de cultivo a utilizar



Norma oficial mexicana NOM-114-SSA1-1994, bienes y servicios. Método para la determinación de salmonella en alimentos.

Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivo selectivo y diferencial, identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.


Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.


1.0 Medios de pre-enriquecimiento


1.1 Agua de peptona tamponada

Fórmula

Ingredientes /Cantidades Unidades

·         Peptona 10,0 g

·         Cloruro sódico 5,0 g

·         Fosfato sódico dibásico 3,5 g

·         Fosfato potásico monobásico 1,5 g

·         Agua 1,0 l

Preparación

·         Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario.

·         Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a 7,0.

·   Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las    porciones necesarias para la prueba.

            ·         Esterilizar por 20 min a 121 ±; 1°C


1.2 Caldo lactosado   

 Fórmula

Ingredientes/Cantidades Unidades

·         Extracto de carne 3,0 g

·         Peptona 5,0 g

·         Lactosa 5,0 g

·         Agua destilada 1,0 l

·         pH final: 6,9 ±; 0,2

Preparación

·         Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65°C.

·         Distribuir en porciones de 225 ml, en frascos de 500 ml.

            ·         Esterilizar durante 15 min a 121°C ±; 1°C.

       

2.0 Caldo de enriquecimiento


2.1 Caldo selenito-cistina

Fórmula

Ingredientes/Cantidades Unidades

·         Triptona o polipeptona 5,00 g

·         Lactosa 4,00 g

·         Fosfato disódico 10,00 g

·         Selenito ácido de sodio 4,00 g

·         L-cistina 0,01 g

·         Agua destilada 1,00 l

·         pH final: 7,0 ±; 0,2 a 25°C

Preparación

·         Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 ml en recipientes estériles, según se requiera.

·         El caldo así preparado es transparente. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación.Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a  110°C±; 1&°C, tomando entonces un color salmón.



2.2 Caldo tetrationato

Fórmula

Ingredientes/Cantidades Unidades


·         Proteosa peptona o triptona 5,0 g

·         Sales biliares 1,0 g

·         Carbonato de calcio 10,0 g

·         Tiosulfato de sodio pentahidratado 30,0 g

·         Agua destilada 1,0 l

·         pH final: 7,0±0,1

Preparación

·         Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril.

·         Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10 y 225 ml, en recipientes estériles. Guardar en refrigeración.

·         Antes de usar el medio, agregar 2 ml de una solución yodo-yoduro y 1 ml de solución de verde brillante al 0,1% por cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo día de su preparación.


2.3 Vassiliadis-Rappaport

Fórmula 

Solución A

Ingredientes /Cantidades Unidades 

  ·         Triptona 5,0 g 

  ·         Cloruro de sodio 8,0 g 

  ·         Fosfato de potasio dihidrogenado 1,6 g

  ·         Agua destilada 1,0 l 

 Preparación. 

Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70°C. 

Solución B

Ingredientes /Cantidades Unidades

  ·         Cloruro de magnesio hexahidratado 400,0 g 

  ·         Agua destilada 1 litro.

  ·         Disolver el cloruro de magnesio en agua.

Como esta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/ml.

Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.


Solución C

Ingredientes/ Cantidades Unidades 

·         Oxalato de verde de malaquita 0,4 g

·         Agua destilada 100,0 ml 

·         Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.

      ·         Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.


Medio completo

Ingredientes/ Cantidades Unidades

·         Solución A 1000 ml

·         Solución B 100 ml

·         Solución C 10 ml

Preparación

Adicionar 1 000 ml de la solución A, 100 ml de la solución B y 10 ml de la solución C.

Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5,2.

Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantidades de 10 ml.

Almacenar en refrigeración.


2.3 Caldo de soya tripticasa

Fórmula

Ingredientes /Cantidades Unidades

·         Tripticasa o triptosa 17,0 g

·         Fitona 3,0 g ·         Glucosa 2,5 g 

·         Cloruro de sodio 2,5 g

·         Agua destilada 1,0 L.

·         pH final: 7,3 ±; 0,2 

 Preparación 

Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa.Distribuir porciones de 225 ml dentro de matraces de 500 ml y esterilizar en autoclave durante 15 min a 121°; C ±; 1°C.



2.4 Leche descremada reconstituida

·        Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada.

·         Agitar circularmente hasta disolución.

·        Distribuir en volúmenes de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml.

·         Esterilizar a 121°C ±; 1°C por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 ml.



 2.5 Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio

·         Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 ml de medio, quedando una        concentración final de sulfito de potasio del 0,5%.  

·         Adicionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en autoclave en la forma habitual.


      3.0 Medios de aislamiento

     

     3.1 Agar verde brillante (VB)

     Fórmula

       Ingredientes /Cantidades Unidades

·         Extracto de levadura 3,0000 g

·         Polipeptona (Proteosa peptona No. 3) 10,0000 g

·         Cloruro de sodio 5,0000 g

·         Lactosa 10,0000 g

·         Sacarosa 10,0000 g

·         Rojo de fenol 0,0800 g

·         Agar 20,0000 g

·         Verde brillante 0,0125 g

·         Agua destilada 1,0000 l

·         pH final: 6,9 ±; 0,2

      Preparación

·         Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. Ajustar el pH.

·         Esterilizar en autoclave por 15 min a 121°C ±; 1°C. El sobrecalentamiento del medio disminuye su selectividad.

·         Enfriar el medio a 50°C y distribuirlo en cajas de petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, de color marrón.

     

 3.2 Agar con sulfito de bismuto

      Fórmula

        Ingredientes /Cantidades Unidades

·         Extracto de carne de res 5,000 g

·         Mezcla de peptonas 10,000 g

·         Glucosa 5,000 g

·         Fosfato disódico (anhidro) 5,000 g

·         Sulfato ferroso (anhidro) 0,300 g

·         Sulfito de bismuto 8,000 g

·         Verde brillante 0,025 g

·         Agar 20,000 g

·         Agua destilada 1,000 l

·         pH final: 7,6 ± 0,2

        Preparación

   Suspender los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH.

     Enfriar a 45°C y verter en cajas de petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado propio del medio.

       El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la coloración es parda, no deben utilizarse.

        El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad.

     

     3.3 Agar xilosa lisina Desoxicolato (XLD)

        Fórmula

           Ingredientes /Cantidades Unidades

·         Xilosa 3,75 g

·         L-lisina 5,00 g

·         Lactosa 7,50 g

·         Sacarosa 7,50 g

·         Cloruro de sodio 5,00 g

·         Extracto de levadura 3,00 g

·         Rojo de fenol 0,08 g

·         Agar 15,00 g

·         Desoxicolato de sodio 2,50 g

·         Citrato férrico-amónico 0,80 g

·         Tiosulfato de sodio 6,80 g

·         Agua destilada 1,00 l

·         pH final: 6,9 ± 0,2

        Preparación

     Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 55°C, agitando   frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH.

        Enfriar a 50°C y verter en cajas de petri estériles. No se esterilice.

      El sobrecalentamiento produce una precipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñas.

El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante.


3.4 Agar para Salmonella y Shigella (SS)

Fórmula

Ingredientes /Cantidades Unidades

·         Extracto de carne 5,000 g

·         Polipeptona * 5,000 g

·         Lactosa 10,000 g

·         Sales biliares 8,500 g

·         Citrato de sodio dihidratado 8,500 g

·         Tiosulfato de sodio pentahidratado 8,500 g

·         Citrato férrico 1,000 g

·         Agar 13,500 g

·         Rojo neutro 0,025 g

·         Verde brillante 0,330 mg

·         Agua destilada 1,000 l

·         pH final: 7,0 ± 0,2

Preparación

Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición hasta disolución completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave.

Enfriar a 50°C y distribuir en cajas de petri estériles en condiciones asépticas.

El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.


3.5 Agar entérico Hektoen

Fórmula

Ingredientes /Cantidades Unidades

·         Proteosa peptona 12,000 g

·         Extracto de levadura 3,000 g

·         Lactosa 12,000 g

·         Sacarosa 12,000 g

·         Salicina 2,000 g

·         Sales biliares 9,000 g

·         Cloruro de sodio 5,000 g

·         Tiosulfato de sodio 5,000 g

·         Citrato amónico férrico 1,500 g

·         Azul de bromotimol 0,064 g

·         Fuscina ácida 0,100 g

·         Agar 13,500 g

·         Agua 1,000 l

·         pH final: 7,5 ± 0,2

Preparación

Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa disolución del agar. No sobre calentar.

Dejar enfriar a 55-60°C y distribuir en cajas de petri estériles en condiciones asépticas.



4.0 Medios para pruebas bioquímicas
4.1 Agar de tres azúcares y hierro (TSI)
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Peptona de carne * 1,0 g
Peptona de caseína * 1,0 g
Cloruro de sodio 0,5 g
Lactosa 1,0 g
Sacarosa 1,0 g
Glucosa 0,1 g
Agar 1,3 g
Rojo de fenol 2,5 mg
Sulfato ferroso amónico
pentahidratado 20,0 mg
Tiosulfato de sodio 20,0 mg
Agua destilada 100,0 ml
pH final: 7,3 ± 0,2
Preparación
Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, hasta disolución completa.
Enfriar a 60°c y ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121°C durante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.
4.2 Agar de hierro y lisina (LIA)
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Peptona de gelatina 0,5 g
Extracto de levadura 0,3 g
Glucosa 0,1 g
L-lisina 1,0 g
Citrato férrico-amónico 50,0 mg
Tiosulfato de sodio anhidro 4,0 mg
Púrpura de bromocresol 2,0 mg
Agar 1,5 g
Agua destilada 100,0 ml
pH final: 6,7 ± 0,2
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm.
El medio ya preparado es de color púrpura.
4.3 Agar nutritivo
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Extracto de carne 3,0 g
Peptona 5,0 g
Agar 15,0 g
Agua destilada 1,0 l
pH final: 6,8 ± 0,2
Preparación
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min.
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su volumen.
Esterilizar a 121°C por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique.
4.4 Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Extracto de carne 3,000 g
Peptona 30,000 g
Hierro peptonizado 0,200 g
Tiosulfato de sodio 0,025 g
Agua destilada 1,000 l
pH final: 7,3 ± 0,2
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una disolución completa.
Enfriar a 50°C y ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en posición vertical.
4.5 Agar citrato de Simmons
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Fosfato de amonio 1,00 g
Fosfato dipotásico 1,00 g
Cloruro de sodio 5,00 g
Citrato de sodio 2,00 g
Sulfato de magnesio 0,20 g
Azul de bromotimol 0,08 g
Agar 15,00 g
Agua destilada 1,00 l
pH final: 6,8 ± 0,2
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una disolución completa.
Ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada.
4.6 Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer)
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Peptona 7,0 g
Dextrosa 5,0 g
Difosfato de potasio 5,0 g
Agua destilada 1,0 l
pH final: 6,9 ± 0,2
Preparación
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta lograr una disolución completa.
Ajustar el pH.
Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
4.7 Caldo manitol
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Extracto de carne 1,000 g
Proteosa peptona 10,000 g
Cloruro de sodio 5,000 g
Rojo de fenol 0,018 g
Manitol 10,000 g
Agua 1,000 l
pH final: 7,4 ± 0,2
Preparación
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH.
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 ml en tubos de 13 x 100 mm.
Esterilizar a 121°C durante 15 min.
4.8 Caldo malonato
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Extracto de levadura 1,000 g
Sulfato de amonio 2,000 g
Fosfato dipotásico 0,600 g
Fosfato monopotásico 0,400 g
Cloruro de sodio 2,000 g
Malonato 3,000 g
Glucosa 0,250 g
Azul de bromotimol 0,025 g
Agua 1,000 l
pH final: 6,7 ± 0,2
Preparación
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH.
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 ml.
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.
4.9 Caldo urea
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Urea 20,00 g
Extracto de levadura 0,10 g
Fosfato monopotásico 9,10 g
Fosfato disódico 9,50 g
Rojo de fenol 0,01 g
Agua 1,00 l
pH final: 6,8 ± 0,2
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 micras o en autoclave de 5 a 8 lb de presión durante 15 min.
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm.
4.10 Caldo de urea rápido
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Urea 20,000 g
Extracto de levadura 0,100 g
Fosfato monopotásico 0,091 g
Fosfato disódico 0,095 g
Rojo de fenol 0,010 g
Agua 1,000 l
pH final: 6,8 ± 0,2
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada.
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 micras
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm.
4.11 Caldo infusión cerebro corazón
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Infusión cerebro corazón 200,0 g
Infusión de corazón de res 250,0 g
Proteosa peptona 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Fosfato disódico dodecahidratado 2,5 g
Dextrosa 2,0 g
Agua destilada 1,0 l
pH final: 7,4 ± 0,2
Preparación
Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente.
Distribuir y esterilizar a 121°C durante 15 min.
5.0 Soluciones
5.1 Solución verde brillante al 0,1% (1:1000)
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Verde brillante 0,1 g
Agua destilada estéril 100,0 ml
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada estéril hasta completar 100 ml.
5.2 Solución de yodo-yoduro
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Cristales de yodo 6,0 g
Yoduro de potasio 6,0 g
Agua destilada 100,0 ml
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 ml.
Conservar en frasco ámbar.
5.3 Solución salina al 0,85%
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Cloruro de sodio 0,85 g
Agua destilada 100,00 ml
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121°C durante 15 min.
5.4 Solución salina formalizada
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Solución de formaldehído (36-38%) 6,0 ml
Cloruro de sodio 8,5 g
Agua destilada 1,0 l
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 121°C durante 15 min.
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml de la solución de formaldehído. No esterilizar después de la adición de formaldehído.
5.5 Reactivo de Kovac
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
p-dimetil-aminobenzaldehído 5,0 g
Alcohol amílico 75,0 ml
Acido clorhídrico concentrado 25,0 ml
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol amílico y después agregar el ácido clorhídrico lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración.
5.6 Solución de alfa-naftol al 5%
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Alfa-naftol 5,0 g
Alcohol 100,0 ml
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 ml.
5.7 Solución de rojo de metilo
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Rojo de metilo 0,10 g
Alcohol etílico 300,00 ml
Agua destilada c.b.p. 500,00 ml
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 ml.
5.8 Solución de hidróxido de potasio al 40%
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Hidróxido de potasio 40,0 g
Agua destilada 100,0 ml
Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 ml.
5.9 Solución de gelatinasa al 5%
Fórmula
Ingredientes Cantidades Unidades
Gelatinasa 5,0 g
Agua 100,0 ml
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destilada. NO CALENTAR.


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