Pruebas de identificación

Identificación bioquímica

·  
    Materiales y reactivos: 
    Incubadora
   Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3mm de diametro
   Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm
  Tubos para serologia de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm 
    Agar triple azúcar hierro (TSI) 
    Agar hierro lisina (LIA)    
    Caldo urea  
    Agar citrato Simmons 
    Medio SIM

·  Caldo RM-VP

   Caldo malonato 

·  Caldo manitol

    Procedimiento:


    Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien  aisladas.

· Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo.

·   Incubar por 24 ±; 2 h a 35°C.

·  Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C las placas con medios selectivos por si es necesario retomar más colonias.

· Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones

Agar TSI

Prueba bioquímica: en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.

Agar LIA

Prueba bioquímica: se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfhídrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.

Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales.

Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios.

Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.

Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento.

Prueba de ureasa 

Prueba de ureasa (convencional). 

Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ±; 2 h a 35°C. 

Prueba de ureasa (rápida).

Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37± 0,5°C en baño de agua. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio).             

Identificación serológica

Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)

· Colocar con un asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo desarrollado en TSI.

·  Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.

·  Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.

·  Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva.

La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.

Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.

·    Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes).

·  Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.

·  Si no se cuenta con los sueros grupo específicos, solicitar la tipificación de la cepa al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública

Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).

·         Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 h a 35°C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24± 2 h a 35°C (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).

·         Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina mezclando 0,5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-55°C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecífica.

Pruebas bioquímicas complementarias

·         Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación:

·         Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.

·         Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:

Agar citrato Simmons 

·         Inocular por estría el tubo.

·         Incubar 96± 2 h a 35 ±2°C. 

·         Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul. 

·         Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.

Medio SIM

·         Inocular por punción.

·         Incubar 24 h a 35 ±; 2°C. 

·         Movilidad.

·         Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.

·         Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente. 

Producción de ácido sulfhídrico.

·         Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.

·         Prueba negativa: ausencia de color negro. 

Producción de Indol 

·         Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.

·         Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.

·         Prueba negativa: sin cambio de color.

Caldo RM-VP

Inocular un tubo con el medio.

Incubar 48 ±; 2 h a 35 ±2°C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. 8.5.2.3.1 

 Prueba de Voges-Proskauer (VP)

·         Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h.

·         Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol. 

·         Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%. 

·         Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).

·         Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35±; 2°C o 4 h a temperatura ambiente.  

·         Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. 

·         Prueba negativa: sin cambio de color.

·         Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ±; 2°C.

Prueba de rojo de metilo (RM)

·         Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.

·         Interpretar los resultados inmediatamente.

·         Prueba positiva: desarrollo de color rojo. 

·         Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. 8.5.2.4

 Caldo malonato 

·         Inocular un tubo conteniendo el medio.

·         Incubar 40 ±; 2 h a 35 ±; 2°C.

·         Prueba positiva: desarrollo de color azul. 

·         Prueba negativa: sin cambio de color. 

Caldo manitol

·         Inocular un tubo conteniendo el medio. 

·         Incubar 24 ±; 2 h a 35 ±; 2°C. 

·         Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. 

·         Prueba negativa: sin cambio de color.