Identificación
bioquímica
·
Materiales y reactivos:
Incubadora
Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3mm de diametro
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm
Tubos para serologia de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm
Agar triple azúcar hierro (TSI)
Agar hierro lisina (LIA)
Caldo urea
Agar citrato Simmons
Medio SIM
· Caldo RM-VP
Procedimiento:
Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.
Materiales y reactivos:
Incubadora
Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3mm de diametro
Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm
Tubos para serologia de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm
Agar triple azúcar hierro (TSI)
Agar hierro lisina (LIA)
Caldo urea
Agar citrato Simmons
Medio SIM
Caldo malonato
· Caldo manitol
Procedimiento:
Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien aisladas.
· Tocar levemente el centro de cada colonia e
inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y otro con agar
hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el
fondo.
· Incubar por 24 ±; 2 h a 35°C.
· Almacenar
en refrigeración de 5 a 8°C las placas con medios selectivos por si es
necesario retomar más colonias.
· Observar el crecimiento en los tubos y considerar
presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes
reacciones
Agar TSI
Prueba bioquímica: en el fondo del tubo se observa vire
del indicador debido a la fermentación de la glucosa; en la superficie del
medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se
observa coloración negra a lo largo de la punción debido a la producción de
ácido sulfhídrico.
Agar LIA
Prueba bioquímica: se observa intensificación del color
púrpura en todo el tubo por la descarboxilación de la lisina. Considerar
negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo
del agar. La mayoría de las cepas de Salmonella producen ácido sulfhídrico en
este medio con ennegrecimiento a lo largo de la punción.
Retener todos los cultivos que muestren las reacciones
características de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas
adicionales.
Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero
que presentan reacciones en LIA típicos, deben trabajarse como cultivos
presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá detectar
S. arizonae y cepas atípicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa.
Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos
medios.
Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con
reacciones típicas. Si el cultivo presenta reacciones atípicas en este medio,
tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atípico
anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.
Continuar la identificación bioquímica y serológica a
partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos
por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de ambos
medios de enriquecimiento.
Prueba de ureasa
Prueba de ureasa (convencional).
Con un asa estéril, tomar crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo
urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire púrpura de las
reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 ±; 2 h a 35°C.
Prueba de ureasa (rápida).
Identificación
serológica
· Colocar con un asa dos gotas separadas de solución
salina estéril sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para
aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo
desarrollado en TSI.
· Agregar a
una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el
canto del asa o empleando aplicadores de madera.
· Agitar
inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un
min. Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.
· Considerar
cualquier grado de aglutinación como positiva.
La prueba positiva resulta cuando se presenta
aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinación en la
gota que contiene el cultivo y la solución salina.
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no
es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioquímicas complementarias.
· Cuando la aglutinación es positiva con el suero
polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los
diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes).
· Si la
aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar
la prueba. Si hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y
repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.
· Si no se
cuenta con los sueros grupo específicos, solicitar la tipificación de la cepa
al Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y
Referencia de la Secretaría de Salud o al Laboratorio Nacional de Salud Pública
Si se requiere, practicar el ensayo de los
antígenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).
· Inocular
el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de
4 a 6 h a 35°C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día),
o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 24± 2 h a 35°C (para ensayo
al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 5 ml del
cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).
· Colocar
0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para
serología (13 x 100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo
formalizado. Preparar un control de solución salina mezclando 0,5 ml de
solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno formalizado. Incubar las
mezclas en baño de agua a 48-55°C. Observar a intervalos de 15 min por espacio
de una hora. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla
de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en
la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se
aglutinan, se considera la prueba inespecífica.
Pruebas
bioquímicas complementarias
· Cuando las
pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no
concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuación:
· Inocular
los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la
presencia de la especie S.
arizonae.
· Interpretar
los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:
Agar citrato Simmons
· Inocular
por estría el tubo.
· Prueba
positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.
· Prueba
negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
· Movilidad.
Producción de ácido sulfhídrico.
Producción de Indol
· Adicionar
al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de
Kovac.
Prueba de Voges-Proskauer (VP)
· Adicionar
0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%.
· Adicionar
algunos cristales de creatinina (opcional).
· Prueba
positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.
· Prueba
negativa: sin cambio de color.
· Prueba
negativa: desarrollo de color amarillo. 8.5.2.4
Caldo malonato
· Inocular
un tubo conteniendo el medio.
· Prueba
negativa: sin cambio de color.
Caldo manitol
· Incubar 24
±; 2 h a 35 ±; 2°C.
· Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.
· Prueba negativa: sin cambio de color.
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