Técnica de siembra y tinciones para la morfología microscópica

La técnica de siembra es estría cruzada la cual consiste en establecer un gradiente de diluciones de estrías cruzadas sobre un medio solido para dar origen a colonias aisladas.

El material que se utiliza en la siembra por estría cruzada es el siguiente:

-asa de inoculación

-caja con medio de cultivo

-mecheros

-incubadora

El procedimiento de la técnica de estría cruzada es el siguiente:

-Esterilizar el asa y cerca del mechero abrir la caja de cultivo

-Con el asa tomar una muestra de la colonia seleccionada

-Descargar la muestra en una pequeña zona de la caja con medio de cultivo cerca de la pared de la caja

-Realizar estrias como se indica en la imagen, esterilizar el asa al inicio de cada estria

-Incubar 35°C por 24 horas

Procedimiento de la técnica de estría cruzada

Después de la incubación de las cajas, se deben observar la morfología colonial y compararla con la morfología típica de Salmonella typhi correspondiente al medio de cultivo.
Se selecciona una colonia aislada y se hace un frotis del cultivo y posteriormente una tinción Gram.
Las salmonellas son bacterias gram-negativas, lo cual significa que no se tiñen de azul con el colorante aplicado en la prueba diseñada por Gram. Esto se debe a que dicho colorante tiñe la pared celular, que en estos casos está cubierta por una membrana externa. Es así que estas bacterias están envueltas por varias capas: la membrana externa, la pared celular (que es diez veces más delgada que en las bacterias gram-positivas), y la membrana interna. La membrana externa e interna delimita al periplasma. La apariencia de las bacterias en el microscopio es de bacilos, o cilindros con puntas redondeadas.
En la de tinción de Gram utilizan los siguientes reactivos y materiales:
-Cristal violeta
-Agua destilada
-Lugol 
-Alcohol-cetona (decolorante)
-Safranina
-Portaobjetos
-Piseta 
-Puente de tinción
-Cristalizador
-Microscopio óptico
-Aceite de inmersión
El procedimiento de la tinción de Gram es el siguiente:
-Cubrir el frotis con dos gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto
-Lavar cuidadosamente el frotis con agua destilada para eliminar el exceso de colorante
-Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con dos gotas de lugol por 30 segundos
-Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya mas tintura
-Lavar con agua
-Aplicar dos gotas de safranina durante 30 segundos
-Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar secar al aire
-Observar al microscopio con seco debil, seco fuerte e inmersión