miércoles, 4 de abril de 2012

Técnica de aislamiento



Materiales 
- Homogeneizador peristáltico (stomacher) 
-Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas                                                
-Licuadora       
-Incubadora     
-Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm                                                                      
-Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y compuestas                     
-Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml           
-Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 ml, graduadas en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón                                                                              -Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro                                                                                                       -Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color

Reactivos 
-Caldo lactosado o  agua de peptona tamponada 225 ml
-Hidróxido de sodio 1N estéril
-Ácido clorhídrico 1N estéril
-Caldo tetrationato 10 ml
-Caldo selenito cistina 10 ml
-Caldo Vassiliadis-Rappaport 10 ml
-Agar xilosa lisina Desoxicolato (XLD)                                                                     -Agar verde brillante (VB)                                                                                                 -Agar entérico Hektoen                                                                                        -Agar Sulfito de Bismuto                                                                                   -Agar SS


-Procedimiento general para la preparación de muestras

Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril (generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min. Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.

-Aislamiento de Salmonella
Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de caldo selenito cistina.



Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport.



Incubar de 18 a 24 h a 35°C o, para alimentos fuertemente contaminados a 42°C por el mismo periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en medios selectivos. Hacer estrías cruzadas esterilizando entre cada estría el asa.



Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina Desoxicolato (XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato. Incubar las placas 24 horas a 35°C


 Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes características:

Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.                                                                                                                  Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.                                                                                         Agar enterico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.                                                                                                         Agar sulfito de bismuto: las colonas típicas de Salmonella pueden ser cafés, grises o negras; con o son brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente a negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tipicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adiocionales.                                                            Agar SS:colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.





Medios de aislamiento para Salmonella





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